PRINSIP KERJA PCR DAN ANALISIS DNA RAPD, RELP DAN RT-PCR

0
86

1. Tuliskan
prinsip kerja dari PCR (Polymerase chain reaction)!

2. Jelaskan
perbedaan analisis DNA dengan menggunakan metode RAPD, RELP, RT-PCR!

Jawaban
1. Jawaban Prinsip Kerja PCR 

Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah teknik yang paling umum digunakan oleh para peneliti bidang Biologi molekuler dan Genetika. Prinsip kerja PCR adalah pada suhu 94-950C, DNA mengalami denaturasi (pembelahan unit ganda menjadi unit tunggal). Waktu yang diperlukan untuk proses ini sekitar 30 detik pada suhu 95 derajat Celsius atau 15 detik pada suhu 97derajat Celsius. Apabila DNA target mengandung banyak nukleotida G/C, suhu denaturasi dapat ditingkatkan. Denaturasi yang tidak lengkap akan menyebabkan renaturasi secara cepat, sedangkan waktu denaturasi yang terlalu lama dapat mempengaruhi enzim polimerase. Hal ini sangat berpengaruh terhadap keberhasilan proses PCR. Umumnya sebelum proses siklus PCR dimulai seringkali dilakukan pre-denaturasi selama 3-5 menit, untuk meyakinkan bahwa molekul DNA target yang ingin dilipat gandakan jumlahnya benar-benar terdenaturasi (Sulandari dkk, 2003).
Apabila suhu diturunkan antara 36-720C terjadi proses penempelan primer (annealing) yang merupakan penempelan primer pada DNA yang telah terbelah pada tempat yang spesifik. Primer sebaiknya berukuran 18-25 basa, mengandung 50-60% G + C, dan Tm (0C) terhitung untuk kedua primer sebaiknya sama. Formula penghitungan adalah, Tm = 4 (G+C) + 2 (A+T). Semakin panjang primernya semakin tinggi temperatur annealing(Sulandari dkk, 2003).
Apabila suhu dinaikkan sampai 72 0 C, maka primer dengan bantuan enzim DNA polymerase akan membentuk untaian DNA sesuai dengan runtutan DNA yang terbelah, proses ini disebut elongasi (extension). Kecepatan penyusunan nukleotida diperkirakan antara 35-100 nukleotida per detik, tergantung buffer, pH, konsentrasi garam, dan molekul DNA target. Umumnya setelah proses siklus PCR selesai, ditambah post elongasi selama 5-10 menit pada temperatur 72 0C agar semua hasil PCR berbentuk untai ganda (Sulandari dkk, 2003).
Ketiga tahapan tersebut merupakan satu siklus termal. Jumlah fragmen DNA yang digandakan adalah 2n dimana n adalah banyaknya siklus termal. Rumus tersebut berasal dari penambahan jumlah keping (copy) DNA secara eksponensial, dimana keping DNA yang terbentuk menjadi cetakan bagi reaksi selanjutnya. Banyaknya siklus yang dilakukan tergantung pada banyaknya produk PCR yang diinginkan (Sulandari dkk, 2003).
Metode PCR ini sangat cocok untuk memperbanyak DNA untuk prosedur pemeriksaan klinis atau forensik, karena hanya diperlukan sampel DNA  yang sangat sedikit sebagai bahan awal. DNA dapat diperbanyak oleh reaksi berantai polimerase dari sehelai rambut atau setetes darah atau semen(Marks dkk, 1996).
PCR adalah suatu molekul perbanyakan DNA secara enzimatik sehingga DNA yang diperoleh dapat digunakan untuk analisis penelitian. DNA yang jumlahnya sangat sedikit juga dapat dikarakterisasi dengan metode ini. Saat ini PCR sudah digunakan secara meluas pada kedokteran forensik, diagnosis genetika, hinggateknik ini banyak digunakan karena cukup spesifik, efisien, dan memiliki derajat keberhasilan yang tinggi(FKUI, 2000).
Istilah “ reaksi berantai “ digunakan karena perpanjangan rantai DNA dilakukan dalam siklus yang
berulang-ulang. Yang diperlukan pada reaksi PCR adalah suatu DNA sasaran yang akan diamplifikasi, sepasang oligonukleotida primer yang masing-masing komplementer dengan ujung 3’ dari salah satu untai DNA sasaran, deoksinukleotida triposfat (d ATP, d CTP, d GTP, dan dTTP) dan suatu enzim DNA polimerase yang tahan terhadap pemanasan tinggi (dikenal  sebagai tag polymerase). Tag polymerase berasal dari bakteri Thermus aquaticus, yang dapat tumbuh dalam sumber air panas bersuhu 100 o C atau lebih (FKUI, 2000).
Dalam polimerisasi DNA dengan teknik PCR, biasanya digunakan molekul DNA sebagai primer. Fungsi primer adalah menyediakan ujung 3’- OH yang akan digunakan untuk menempelkan molekul DNA pertama dalam proses polimerisasi (Yuwono, 2005).
Mula-mula harus dilakukan isolasi terhadap sampel DNA yang mengandung segmen yang akan diampllifikasi. Ditambahkan primer, keempat deoksiribonukleosida triposfat, dan DNA polimerase tahan panas dalam jumlah besar kedalam larutan dimana DNA dipanaskan untuk memisahkan untai-untai. Primer adalah dua oligonukleotida sintetik. Setiap oligonukleotida bersifat komplementer terhadap urutan yang pendek pada satu untai DNA untuk diamplifikasi. Sewaktu larutan mendingin, oligonukleotida membentuk pasangan basa dengan DNA dan berfungsi sebagai primer untuk sintesis untai DNA yang dikatalisis oleh DNA polimerase tahan panas. Keempat deoksiribonukleosida triposfat berfungsi sebagai prekursor untuk sintesis untai DNA baru. Proses pemanasan, pendinginan, dan sintesis DNA baru diulang berkali-kali sampai diperoleh salinan DNA dalam jumlah besar. Proses dapat diautomasikan sehingga setiap putaran replikasi hanya memerlukan waktu beberapa menit. Dalam 20 daur pemanasan dan pendinginan, DNA mengalami amplifikasi lebih dari sejuta kali (Marks dkk, 1996). Ada 3 tahap dalam kerja PCR, yaitu :
Denaturing adalah proses memisahkan 2 untai pilinan DNA. Pada tahap ini, ikatan hidrogen yang menyatukan kedua pilinan itu terlepas sehingga masing-masing akan menjadi untai tunggal. Biasanya suhu Denaturing berkisar antara 92-94 derajat celcius.
Annealing adalah tahapan dimana primer forward dan reverse mencari pasangannya di untai-untai DNA. Jika pas….. maka dia akan melekat. Suhu Annealing biasanya berkisar antara 40-55 derajat Celcius. Suhu yang biasanya umum dipakai adalah 50-52 derajat C.
Setelah itu, mesin PCR akan kembali memanaskan ‘sup DNA’ lagi ke suhu 72 derajat celcius agar Taq polymerase bekerja menggandakan potongan DNA.

2.   Analisis DNA dengan menggunkan beberapa metode sebagai berikut :

A. Metode RT- PCR

Dapat mendeteksi produk amplifikasi pada tiap siklus pada proses penggandaan DNA. Pada sistem Real-Time PCR ini terdapat enzim DNA polimerase yang memiliki aktivitas pada DNA yang memiliki fungsi exonuclease pada rantai DNA 5’ menuju 3’. DNA polimerase ini dapat menguraikan molekul probes yang terikat pada untaian tunggal DNA sehingga dapat digunakan untuk deteksi amplikon pada target DNA yang spesifik. 
Molekul probes ini mengikat oligonukleotida dan akan mengikat sekuen DNA target. Probes ini terikat pada ujung 5’P dan pada ujung 3’ ( Arya, 2005 ). Molekul probes ini memiliki bagian reporter dye pada ujung 5’ yang dapat mengeluarkan floresensi sedangkan pada ujung 3’ terdapat quencher yang dapat meredam floresensi pada reporter dye. Sehingga sebelum reaksi emisi dari reporter dye tidak dapat terbaca pada detektor ( Arya, 2005 ).
Real-Time PCR memiliki keunggulan daripada konvensional PCR yaitu pada Real-Time sistem pengukuran analisis menggunakan molekul probes yang dapat diukur pada tiap siklus reaksinya, pada konvensional PCR deteksinya memerlukan gel agarosa untuk proses elektroporesis DNA pada deteksi produk hasil amplifikasi DNA tersebut ( Soheili dkk, 2005 ).

B. Metode RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA).

Random amplified polymorphic DNA (RAPD) merupakan salah satu marka molekuler berbasis PCR yang banyak digunakan dalam mengidentifikasi keragaman pada tingkat intraspesies maupun antarspesies (Qian et al., 2001, Adam et al., 2002, Jena dan Das, 2006). Teknik ini mendeteksi polimorfisme ruas nukleotida pada DNA dengan menggunakan sebuah primer tunggal yang memilikirangkaian nukleotida acak. Pada reaksi PCR-RAPD ini, sebuah primer menempel pada DNA genomik pada dua tempat berbeda dari DNA komplementer. Jika tempatpenempelan primer ini berada pada daerah yang dapat diamplifikasi, maka hasil DNA tertentu dapat dihasilkan melalui amplifikasi siklus termal. Umumnya masing-masing primer menyebabkan amplifikasi beberapa lokus (Welsh dan McClelland, 1990, Williams et al., 1990).
Marka RAPD bersifat lebih sederhana dibandingkan marka lainnya seperti mikrosatelit atau simple sequencerepeat (SSR), restriction fragment length polymorphism RFLP) ataupun amplified length polymorphism (AFLP) (Bardakci, 2001). Hal ini dikarenakan teknik RAPD tidak memerlukan informasi awal mengenai urutan DNA genom organisme yang diuji maupun tidak memerlukan probe DNA yang spesifik (Williams et al., 1990). 
Walaupun metode RAPD relatif cepat, murah dan gampang dilaksanakandibandingkan metode marka DNA lain, konsistensi atau reproducibility hasil PCR menjadi perhatian sejak dipublikasikannya teknik ini. Primer RAPD dapat tidak cocok secara sempurna pada urutan penempelan primer, akibatnya amplifikasi pada beberapa siklus mungkin tidak terjadi, sehingga band tetap samar atau bahkan amplifikasitidak terjadi jika primer tidak berhasil menempel pada DNA cetakan (Lamboy, 1994).
RAPD atau teknologi polimorpisme amplifikasi fragmen DNA dalam pelaksanaannyamembutuhkanbantuan PCR adalahsebuahmetode in vitro yang efektif untuk memperbanyak sekuen DNA spesifik, sehingga sering dinamakan metode analisis RAPD PCR. Teknik PCR ini memanfaat kandungan sifat utama DNA, yaitu komplementasi basa-basanya (A=T; G=C) dan anti paralelisme dari kedua rantai DNA-nya. Amplifikasi DNA dengan teknik ini secara teknis dapat memberikan keuntungan dibandingkan metode-metodelainnya. Untuk mendapatkan karakterisasi sampel, metode ini dapat dikatakan sederhana, cepat dan akurat.
Marka RAPD dapat dilakukan dengan mengamplifikasi DNA secara random primer. Adanya polimorphic DNA dapatdideteksi di bawah cahaya ultraviolet setelah sebelumnya gel elektroforesis diberi Etidhium Bromida (EtBr) sehingga dapat menimbulkan pendaran. Semakin banyak jenis primer yang digunakan akan menambah besar kemampuan mendeteksi perubahan yang kecil dan pasangan basa DNA genom (Ishak, 1998).
Beberapa kelebihan dari teknik analisa RAPD ialah pelaksanaannya lebih cepat, hanya membutuhkan sampel DNA dalam jumlah sedikit (0,5-50 nm) dan tidak membutuhkan radioisotop (Demeke dan Adam, 1994). Selain itu menurut Yu dan Pauls (1994), RAPD tidak membutuhkan informasi sekuen DNA lebih dulu dan prosedurnya lebih sederhana.
Sedangkan kelemahan dari teknik RAPD adalah tidak dapa tmembedakan individu homozigot dan heterozigot karena bersifat sebagai penanda dominan serta sulit mendeteksi perubahan yang kecil pada struktur DNA (gen), kecuali jika menggunakan lebih dari 500 jenis primer (Schmidt et al., 1993 dalam Ishak, 1998). Selain itu RAPD menghasilkan data yang tidak spesifik dan tidak kodomain, namun karena kemudahan dan kecepatan dalam menganalisa data, maka teknik ini banyak digunakan.

C. Metode RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisme)

Penanda RFLP ini telah digunakan sejak tahun 1980 yang mempunyai kemampuan menandai suatu segmen dari genom yang mengandung sifat ekonomi penting. Metode ini dapat digunakan untuk menganalisa secara molekuler keragaman genetik diantara individu dalam suatu populasi. Selain itu teknik ini mempunyai spesifitas sampai tingkat inter spesies dimana adanya mutasi pada daerah non coding DNA menyebabkan perbedaan tempat pemotongan oleh enzim tersebut dapat dipisahkan melalui elektroforesis gel agarosa. Perbedaan pola potongan DNA atau polimorfisme tersebut akan diwariskan kepada generasi berikutnya. Metode analisa ini juga dapat digunakan untuk menentukan kesamaan dan perbedaan kedua gen (Primarcket al., 1998).
Kelebihan lain dari penggunaan metode ini adalah kemampuan dalam menandai adanya polymorphisme pada sites sequences nucleotid yang ditunjukkan melalui pola pemotongan restriksi enzim endonuklease. Polymorphisme akan menghasilkan perbedaan ukuran fragmen yang terpotong, sehingga setiap siklus restriksi dapat dipetakan.

Manfaat Analisis RFLP

Terlepas dari kenyataan bahwa itu kurang banyak digunakan sekarang, ada banyak manfaat untuk analisis RFLP. Hal ini memainkan peran penting dalam memungkinkan para ilmuwan untuk memetakan genom manusia serta memberikan informasi tentang penyakit genetik. Analisis RFLP berguna untuk menemukan di mana gen khusus untuk penyakit terletak pada kromosom. Hal ini dilakukan dengan melihat DNA dari satu set anggota keluarga yang menderita penyakit ini dan kemudian mencari alel RFLP yang berbagi jenis yang sama dari pola warisan untuk kondisi tersebut. Dengan menggunakan analisis RFLP, para ilmuwan kemudian dapat menentukan orang lain yang mungkin berisiko untuk penyakit atau pembawa gen bermutasi. Selain manfaatnya untuk pengujian penyakit genetik, RFLP juga salah satu metode pertama digunakan untuk mengetik genetik – juga dikenal sebagai sidik jari genetik, profiling atau pengujian. Aplikasi ini digunakan untuk menyediakan profil genetik seseorang, yang kemudian dapat digunakan untuk membandingkan dengan sampel di TKP atau untuk mengetahui ayah seseorang. Tidak hanya itu, tapi analisis RFLP juga memiliki peran dalam membantu pemahaman kita tentang aspek genetik pola pemijahan yang berbeda di berbagai hewan.

LEAVE A REPLY

Please enter your comment!
Please enter your name here